时隔2个月,“器官特异性纳米颗粒” 再发Nature子刊!
蛙蛙 2020-06-29

1.png

第一作者:魏妥,程强

通讯作者:Prof. Daniel J. Siegwart

通讯单位:美国德克萨斯大学西南医学中心


CRISPR-Cas9作为一种强大的基因编辑工具,已被广泛应用于生物医学领域的各个方面。目前,递送CRISPR-Cas9 核酸酶系统主要有三种方式:质粒递送、Cas9mRNA/sgRNA共递送和Cas9/sgRNA核糖核蛋白 (RNPs)递送。由于低脱靶效应和低免疫原性的优势, RNPs递送越来越受到科学家们的青睐。然而RNPs具有分子量大、负电性强以及易失活等缺点,体内递送极具挑战。

 

奇物论曾报道过美国德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授课题组发表于Nature Nanotechnology的“器官选择性靶向(SORT)纳米颗粒”,在mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的应用方面发挥巨大潜力。(深度解读,附专访


2.png

近日,该课题组又乘胜追击,通过对传统脂质纳米颗粒(LNPs)的简单改造,成功解决了RNPs的体内递送难题,并高效介导了体内器官选择性的基因编辑(图1)。相关研究成果发表于Nature Communications上,题为“Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteinsfor effective tissue specific genome editing”。

 

3.png


图1 |脂质纳米颗粒5A2-DOT-X LNPs体内靶器官递送Cas9/sgRNA RNPs的策略。

 

研究亮点:

1.本文开发的脂质纳米颗粒5A2-DOT LNPs可实现Cas9/sgRNA RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑;

2.5A2-DOT LNPs可同时敲除多个基因位点,成功、快速地构建了器官特异性小鼠肿瘤模型;

3. 5A2-DOTLNPs可成功实现对小鼠疾病模型的基因编辑治疗,对遗传类疾病的治疗具有广泛的应用前景。

 

要点1: 5A2-DOT LNPs的开发过程

通常,LNPs包裹RNA的过程是在酸性缓冲液中完成。在酸性条件下,LNPs中的可电离阳离子脂质(ionizable cationic lipid)会带上正电荷,从而完成对负电荷RNA的包裹。与RNA不同,Cas9/sgRNA RNPs在酸性条件下极易失去活性,而在中性条件下更稳定。因此,研究人员必须尝试在中性缓冲液中包裹Cas9/sgRNA RNPs。可惜的是,可电离阳离子脂质在中性环境中并不会发生质子化,因此无法吸引带负电荷的Cas9/sgRNA RNPs。基于前期积累的经验,Daniel J. Siegwart教授课题组在LNPs原有的四种核心脂质的基础上引入了第五种阳离子脂质(DOTAP),这样不仅能增强其在中性条件下对Cas9/sgRNA RNPs的包载,而且保留了传统LNPs的高效递送能力。通过该策略,他们成功地将Cas9/sgRNA RNPs递送到细胞内,基因编辑效率高达80%以上。

 

要点2:5A2-DOT LNPs可实现对 RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑

   

    研究人员发现,将包裹Cas9/sgTOMRNPs的5A2-DOT-10 LNPs局部注射到tdTOM模型小鼠的肌肉和脑部,可成功实现对小鼠肌肉细胞和脑细胞的基因编辑,激活tdTomato基因并使之表达红色荧光。(图2a-e)

 

基于该课题组前期开发的Selective ORgan Targeting (SORT)技术,研究人员在原有四种脂质组分比例(5A2-SC8 :DOPE: Chol : PEG = 15:15:30:3)的基础上,通过调节DOTAP的摩尔比(5%-60%)制成了一系列包裹Cas9/sgTOM RNPs的5A2-DOT-X LNPs,并将其静脉注射到tdTOM模型小鼠和C57BL/6小鼠中。研究发现,随着DOTAP摩尔百分比的增加,基因编辑逐渐从小鼠肝脏转移到肺部,且肺部基因编辑效果更高。此外,研究人员还发现在低剂量下(0.33 mg kg−1 sgRNA),5A2-DOT-50LNPs可高效递送多达6种sgRNA到小鼠肺部,并成功对针对的6个基因位点进行基因敲除。(图2f-j)

 

1593396123656891.png

图2 | Cas9/sgRNA RNPs的体内靶器官递送和高效基因编辑。

 

要点3:5A2-DOT LNPs可快速构建器官特异性小鼠肿瘤模型

 

鉴于5A2-DOT LNPs可同时敲除多个基因位点,这对快速构建复杂的小鼠肿瘤模型具有极大的优势。因此,研究人员通过肝靶向纳米载体(5A2-DOT-5 LNPs)和肺靶向纳米载体(5A2-DOT-50 LNPs)分别递送多种不同的sgRNAs, 成功构建了小鼠肝癌模型和肺癌模型。该方法简单、快捷,为新型小鼠肿瘤模型的建立提供了新的思路。

 

1593396145726511.png

图3 | 5A2-DOT LNPs可简化小鼠肝癌模型和肺癌模型的构建。

 

要点4:5A2-DOTLNPs可成功实现对小鼠遗传类疾病模型的基因编辑治疗

 

研究人员进一步探索了5A2-DOT LNPs对小鼠遗传类疾病模型的治疗潜力。通过与德克萨斯大学西南医学中心Eric N. Olson教授课题组合作,将包裹Cas9/sgDMD RNPs 的5A2-DOT-10 LNPs局部肌肉注射到杜氏肌营养不良症模型小鼠(ΔEx44 DMDmice)中,可成功对模型鼠肌肉细胞中的突变基因进行基因编辑和修复,并成功恢复了dystrophin蛋白在肌肉中的表达。(图4a-c)

 

接着,研究人员探索了肝靶向基因编辑的治疗潜力,以PCSK9为研究靶点。静脉注射5A2-DOT-5 Cas9/sgPCSK9 RNPs到小鼠体内后,成功在小鼠肝脏中检测到PCSK9位点的基因编辑,且使小鼠血清中PCSK9蛋白的表达水平显著降低。(图4d-f)

 

1593396162863699.png

图4 | 5A2-DOT LNPs可成功实现对小鼠遗传类疾病模型的基因编辑治疗。

 

小结:

本文提供了一种器官选择性递送RNPs的有效策略。在传统脂质纳米颗粒组分的基础上引入一个永久性阳离子脂质,改进了包载RNPs的方法,使之能在中性缓冲液中进行,从而达到保护Cas9蛋白生物活性的目的。通过调节永久性阳离子脂质的加入比例,该文成功实现了RNPs的系统递送和器官选择性基因编辑。开发的RNPs递送体系不仅可以简化小鼠原位肿瘤模型的构建,还表现出了在遗传类疾病中基因治疗的应用价值。

 

参考文献及原文链接:

Wei,T., Cheng, Q., Min, Y. et al. Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing. Nat Commun 11,3232 (2020).

https://doi.org/10.1038/s41467-020-17029-3

 

通讯作者:

1593396184924031.png

DanielJ. Siegwart是德克萨斯大学西南医学中心的副教授。他的研究计划专注于开发先进的基于聚合物和脂质的系统,该系统可精确控制大分子的结构、顺序和响应性,以用于药物输送、成像、遗传疾病和癌症。他是ReCode Therapeutics公司的共同创始人,致力于修饰tRNA负载的纳米颗粒,用于纠正引起囊性纤维化和其他疾病的无义突变。

加载更多
227

版权声明:

1) 本文仅代表原作者观点,不代表本平台立场,请批判性阅读! 2) 本文内容若存在版权问题,请联系我们及时处理。 3) 除特别说明,本文版权归纳米人工作室所有,翻版必究!
纳米人
你好测试
copryright 2016 纳米人 ICP备16031428号

关注公众号